紀(jì)寧生物亞硝酸還原酶(NiR)測(cè)試盒測(cè)定意義介紹如下:
注 意:正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
硝酸還原酶(NiR)是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶,廣泛存在于微生物及植物體內(nèi),是自然界氮循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶,可以將亞硝酸鹽降解為 NO 或 NH3,從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累,降低因亞硝酸鹽累積而造成的對(duì)生物體的毒害作用。
測(cè)定原理:
亞硝酸還原酶可將 NO2—還原為 NO,使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的 NO2—減少,即 540nm處吸光值的變化可反映亞硝酸還原酶的活性。
需自備的儀器和用品:天平、研缽、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、水浴鍋、低溫離心機(jī)。
試劑的組成和配制:
提取液:液體 112mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 4mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存。臨用前加 5mL 蒸餾水溶解。
試劑三:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。(如出現(xiàn)沉淀可以 70-80℃加熱溶解)
試劑四:液體 10mL×1 瓶,4℃避光保存。(如出現(xiàn)沉淀可以 70-80℃加熱溶解)
試劑五:液體 10mL×1 瓶,4℃避光保存。
工作液:臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以 1:1 的比例混合。
酶液提?。?
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2.細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(10?個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔 7 秒,總時(shí)間 3min);然后 10000g,4℃離心 10min,取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定操作表:
空白管 對(duì)照管 測(cè)定管
樣本(μL) 20 20
蒸餾水(μL) 20 40
試劑一(μL) 40 40
試劑二(μL) 40 40 40
混勻后,25℃反應(yīng) 1h
試劑三(μL) 40 40 40
充分震蕩 30S
上清液(μL)70 70 70
工作液(μL)140 140 140
充分混勻,,靜置 3min 后測(cè)定各管 540nm 處吸光值,分別記為 A 空白管、A 對(duì)照管、A 測(cè)定管??瞻坠苤灰鲆还?,每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
計(jì)算公式:
a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 1.3594x + 0.0072,R2 = 0.9997;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y 為吸光值(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)。
1.按照蛋白含量計(jì)算
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每小時(shí)還原 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。
NiR(μmol/h /mg prot)= [A 空白管-(A測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷(V 樣×Cpr)÷T = 1.47×(A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072)÷Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活單位定義:每克組織每小時(shí)還原 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。
NiR(μmol/h/g 鮮重)=[A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T =1.47×(A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072)÷W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活單位定義:每 10?個(gè)細(xì)胞每小時(shí)還原 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。NiR(μmol/h /10?cell)= [A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T = 1.47×(A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072)÷細(xì)胞數(shù)量V 標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)液體積,0.04mL;V 樣:體系中加入樣本體積,0.02mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:
反應(yīng)時(shí)間,1h; Cpr:樣本蛋白含量;W:樣本質(zhì)量,g
b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.6797x + 0.0072,R2 = 0.9997;x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL),y 為吸光值(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白
管)。
1.按照蛋白含量計(jì)算
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每小時(shí)還原 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。NiR(μmol/h /mg prot)= [A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V 標(biāo)÷(V 樣×Cpr)÷T = 2.94×(A 空白管-A 測(cè)定管+A對(duì)照管-0.0072)÷Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活單位定義:每克組織每小時(shí)還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。NiR(μmol/h/g 鮮重)=[A 空白管-(A測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V 標(biāo)÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T =
2.94×(A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072)÷W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活單位定義:每 10?個(gè)細(xì)胞每小時(shí)還原 1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。NiR(μmol/h /10?cell)= [A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷0.6797×V 標(biāo)÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T = 2.94×(A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072)÷ 細(xì)胞數(shù)量V 標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)液體積,0.04mL;V 樣:體系中加入樣本體積,0.02mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:
反應(yīng)時(shí)間,1h; Cpr:樣本蛋白含量;W:樣本質(zhì)量,g
注意事項(xiàng):
1. 配制好的工作液 3 天內(nèi)使用完。
2. 若吸光值超過(guò) 1.5,將上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
3. 嚴(yán)格控制顯色時(shí)間,否則會(huì)對(duì)結(jié)果有影響。
4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為 0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。
5. A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)線性范圍為 0.02-1.5。
上海紀(jì)寧生物科技有限公司自成立以來(lái),一向以“優(yōu)異亞硝酸還原酶(NiR)測(cè)試盒的產(chǎn)品,優(yōu)惠的報(bào)價(jià)和交心的服務(wù)”得到廣闊新老客戶的必定和支撐,不斷提高自身的專業(yè)技術(shù)水平和服務(wù)質(zhì)量,為您提供非常好的產(chǎn)品。