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在原核蛋白表達體系中,如E.coli(大腸桿菌表達系統(tǒng)),外源基因通常需要誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)才能進行表達,本文詳細講述了常用誘導(dǎo)劑IPTG 誘導(dǎo)原理,對外源蛋白誘導(dǎo)表達原理以及實驗步驟。
原核生物絕大多數(shù)的基因按功能相關(guān)性成簇地排列,且密集于染色體上,共同形成一個轉(zhuǎn)錄單位——操縱子,也稱基因表達的協(xié)同單位。E.coli 的乳糖操縱子含Z、Y 及A 三個結(jié)構(gòu)基因,分別編碼β -半乳糖苷酶(β-galactosidase)、通透酶(permease)和乙?;D(zhuǎn)移酶(transacetylase);此外還有調(diào)控基因:操縱序列O(operator)、啟動序列P(promoter);而I(編碼Lac 阻遏物,Lac repressor)不屬于乳糖操縱子。
乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因
IPTG 誘導(dǎo)原理Lac 阻遏物是一種具有4 個相同亞基的四級結(jié)構(gòu)蛋白,都有一個與誘導(dǎo)劑結(jié)合的位點。在沒有乳糖存在時,lac操縱子(元)處于阻遏狀態(tài),Lac阻遏物(即下圖中的阻遏蛋白)能與操縱基因O 結(jié)合,阻礙RNA 聚合酶與P序列結(jié)合,阻止了轉(zhuǎn)錄的路徑,從而抑制轉(zhuǎn)錄啟動。而當(dāng)有誘導(dǎo)劑(這里指IPTG)存在時,誘導(dǎo)劑可與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生變化,導(dǎo)致阻遏物從操縱基因O上解離下來,RNA 聚合酶不再受阻礙,啟動子P開始發(fā)生轉(zhuǎn)錄,啟動反應(yīng)開始發(fā)生轉(zhuǎn)錄。在這個操縱子(元)體系中,真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞,經(jīng)β-半乳糖苷酶催化,轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?mdash;—即生理上的誘導(dǎo)劑。而在實驗中,通常選用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作為誘導(dǎo)劑,IPTG是一種作用極強的誘導(dǎo)劑,不被細菌代謝而十分穩(wěn)定,因此被實驗室廣泛應(yīng)用。這種作用極強的誘導(dǎo)劑,不被細菌代謝而十分穩(wěn)定,因此被實驗室廣泛應(yīng)用。