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IPTG
異丙基硫代半乳糖苷(IPTG, CAS:367-93-1),能夠廣泛應用于生化科研及診斷產(chǎn)品開發(fā)領域。Lac啟動子是使用最早、研究最詳細的啟動子之一,所以目前用于誘導重組蛋白表達的誘導劑主要是IPTG和乳糖。在重組蛋白的誘導表達過程中,誘導劑對于外源基因高效、穩(wěn)定的表達起著非常重要的作用。
異丙基-β-D-硫代半乳糖苷,常與X-Gal或Bluo-Gal結合使用,用于重組細菌菌落的藍白篩選。IPTG不被菌體代謝,為乳糖類似物,一旦進入細胞就會產(chǎn)生持續(xù)長久的誘導效果,所以IPTG的誘導效率高,往往只需要很少量(1 mmol/L)即可達到理想誘導效果。由于IPTG不被代謝,在胞內專一誘導外源蛋白的表達。不受細胞代謝的影響,誘導效果持續(xù)穩(wěn)定。 然而由于IPTG 對于人體具有潛在的毒性,當利用IPTG誘導表達應用于人體的重組藥物時,有可能對最終的產(chǎn)品帶來一些不利影響。另一方面,IPTG的價格也較為昂貴,尤其是在較大體積的發(fā)酵罐中進行誘導時,IPTG 的應用會造成發(fā)酵成本的增加。
乳糖是一種二糖,沒有毒性,另外,由于其低廉的價格,使其有可能成為替代IPTG 的誘導劑。乳糖本身作為一種碳源,可以被菌體所代謝利用,同時,作為一種糖類物質,它的存在亦會導致菌體的生理及生長特性發(fā)生變化。 與IPTG 所不同的是,乳糖自身無法進入到菌體細胞的內部,它需要借助于乳糖透過酶的作用,乳糖的轉運因此受多種因素的影響。另外,乳糖進入細胞后仍然不能誘導Lac 啟動子的啟動。它需要經(jīng)過β-半乳糖苷酶的作用轉化為異乳糖才會起到誘導劑的作用。與IPTG相比,利用乳糖作為誘導劑其誘導過程更為復雜和麻煩,而且誘導效果也遠遠不及。
E.coli的乳糖操縱子(元)含Z、Y及A三個結構基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙?;D移酶,此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調節(jié)基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白,后者與O序列結合,使操縱子(元)受阻遏而處于關閉狀態(tài)。
圖1為大腸桿菌乳糖操縱子IPTG誘導機制。
在啟動序列P上游還有一個分解(代謝)物基因激活蛋白(CAP)結合位點。由P序列、O序列和CAP結合位點共同構成lac操縱子的調控區(qū),三個酶的編碼基因即由同一調控區(qū)調節(jié),實現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調表達 。在沒有乳糖存在時,lac操縱子(元)處于阻遏狀態(tài)。此時,I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合,阻礙RNA聚合酶與P序列結合,抑制轉錄起動。當有乳糖存在時,lac操縱子(元)即可被誘導。在這個操縱子(元)體系中,真正的誘導劑,并非乳糖本身。乳糖進入細胞,經(jīng)b-半乳糖苷酶催化,轉變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白,使蛋白構象變化,導致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉錄。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強的誘導劑,不被細菌代謝而十分穩(wěn)定,因此被實驗室廣泛應用。
資料來源:
[1]李攀峰,張洪斌,胡雪芹. IPTG與乳糖聯(lián)合誘導重組大腸桿菌右 旋糖酐蔗糖酶表達[J]. 食品科學,2014,35(01):185-188.
[2] 細菌誘導表達系統(tǒng).生物極客。
[3] 誘導蛋白表達的選擇,IPTG VS乳糖 ?. 愛西寶資訊。