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由于具有簡單的比色讀數(shù),基于過氧化物酶的檢測方法備受關(guān)注,例如辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體用于免疫組織化學和ELISA、納米酶和DNA酶。自從3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)首次在基于HRP的免疫分析中應(yīng)用以來,TMB是迄今為止最常用的生色底物,其顯色反應(yīng)基于H2O2存在下HRP催化氧化TMB。在TMB出現(xiàn)之后,逐漸取代了其他聯(lián)苯胺衍生物在比色測定中的使用。在研究和評估納米酶的過氧化物酶和氧化酶樣活性的過程中,TMB在大多數(shù)情況下被用作標準底物。取代其他聯(lián)苯胺衍生物的一個重要原因是它們的高致癌性。聯(lián)苯胺衍生物的發(fā)色敏感性是分析化學最重要的參數(shù)之一,但從化學角度明確闡述TMB的變色原理優(yōu)于其他聯(lián)苯胺底物具有重要意義。
近期,四川大學吳鵬教授課題組報道了聯(lián)苯胺類底物的化學性質(zhì)與顯色反應(yīng)的分析性能之間的關(guān)聯(lián)。該體系選擇了九種具有不同特性(不同取代基和不同取代數(shù))的聯(lián)苯胺衍生物,并用四個典型的TMB生色系統(tǒng)(HRP,納米酶,DNAzyme,光敏氧化方案)進行了研究。在現(xiàn)有聯(lián)苯胺底物用于過氧化物酶的測定中,TMB表現(xiàn)出最高的靈敏度,更好的有色產(chǎn)物色純度和合理的氧化產(chǎn)物穩(wěn)定性。與TMB以外的兩種四取代的聯(lián)苯胺衍生物進行比較,TMB的性能(靈敏度,色純度和有色產(chǎn)物的穩(wěn)定性)具有很大優(yōu)勢,在比色測定中證實了其“選定底物”的狀態(tài)。相關(guān)成果以“The Rationale of 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) as the Chromogenic Substrate in Colorimetric Analysis”為題發(fā)表在國際分析化學權(quán)威雜志Analytical Chemistry上(DOI: 10.1021/acs.analchem.0c02149)。
圖一、聯(lián)苯胺類似物與四個顯色反應(yīng)系統(tǒng)之間定量比較的示意圖
首先,作者研究了對不同聯(lián)苯胺底物的選擇。TMB氧化的顯色反應(yīng)基于以下核心部分:聯(lián)苯胺,其包含兩個易于氧化的氨基,可以通過單電子和兩電子途徑被氧化為有色產(chǎn)物。取代基的給電子和吸電子性質(zhì)會影響氨基上的電子云密度,因此可能影響聯(lián)苯胺衍生物的氧化反應(yīng)性。從平均局部電離能圖可以看出,聯(lián)苯胺上氨基的電子云密度低于3,3'-二羥基聯(lián)苯胺但高于3,3'-二氯聯(lián)苯胺,表明這三種衍生物的反應(yīng)活性可能不同。另外,作者確定了九種聯(lián)苯胺底物的光譜特征,其中聯(lián)苯胺在近紫外線范圍內(nèi)表現(xiàn)出典型的吸收帶。
圖二、聯(lián)苯胺衍生物的顯色反應(yīng),結(jié)構(gòu)以及部分底物的ALIE圖。
接著,作者研究了聯(lián)苯胺底物的氧化特性。由于聯(lián)苯胺的氧化過程分兩個步驟進行,以TMB為例,371 nm和652 nm帶是由二胺(TMB)作為供體和二亞胺基離子(TMB2+)作為受體組成的電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。根據(jù)兩個吸收峰之間的差異,可以將7種底物(2Cl除外)分為三類:差異組(4CH3和2CH3),部分重疊的組(2H和2OCH3)和一個重疊的組(2NH2和2OH)。通常,甲基取代的聯(lián)苯胺衍生物比其他的具有更好的差異吸收峰。4CH3(TMB)和2CH3的色純度通常優(yōu)于其余衍生物,并且TMB的半高全寬也小于靜止的基板,這些結(jié)果證明了TMB(4CH3)的光譜和色純度可以在吸收測量和肉眼讀數(shù)方面實現(xiàn)更好的量化。為了研究七種聯(lián)苯胺底物的敏感性,作者使用四個生色系統(tǒng)對其進行測試。圖三中總結(jié)了七個生色系統(tǒng)中七個聯(lián)苯胺類似物的相對靈敏度。通常,CH3-和OCH3-取代的聯(lián)苯胺衍生物的敏感性高于其他衍生物。無論發(fā)色系統(tǒng)如何,4CH3(TMB)都表現(xiàn)出最高的靈敏度,證實了其在比色測定中的“選定底物”狀態(tài)。酶動力學參數(shù)的測量也表明4CH3(TMB)在顯色系統(tǒng)中通常表現(xiàn)出較高的Vmax和較低的Km。
圖三、聯(lián)苯胺衍生物的氧化特性和敏感性研究表征圖。
最后,作者研究了氧化產(chǎn)物的穩(wěn)定性。有色物質(zhì)的穩(wěn)定性對于比色測定中的定量非常重要。作者通過“C點和LED”光敏系統(tǒng)探索了用于收集被氧化底物的吸光度變化。聯(lián)苯胺底物的顏色讀數(shù)與氧化產(chǎn)物穩(wěn)定性之間的區(qū)別已通過其氧化還原電勢進行了驗證。從4CH3(TMB)獲得了分別對應(yīng)于單電子和雙電子氧化的兩對氧化還原峰,良好分離的峰表明兩個氧化步驟可以逐步進行而基本不重疊。從1 h后單電子氧化產(chǎn)物的吸收光譜變化中證實了它還保證了單個氧化產(chǎn)物的穩(wěn)定性。對于2OCH3,由于單電子和兩電子氧化產(chǎn)物的混合物共存,兩個氧化峰之間存在明顯的重疊,另外這種氧化產(chǎn)物不穩(wěn)定,并在短時間內(nèi)自發(fā)地轉(zhuǎn)變?yōu)閮呻娮訉?yīng)物,使吸光度測量成為問題。對于2NH2,氧化還原峰很難區(qū)分,并且在一步中就被氧化成兩電子產(chǎn)物,但是相對較低的氧化電位(0.13 V)使2NH2易于在空氣中發(fā)生自氧化。在7種底物中,4CH3(TMB)的電勢差最大,因此難以形成混合氧化產(chǎn)物,并且TMB的兩電子氧化產(chǎn)物可保持穩(wěn)定至少1 h。該研究證實了TMB在單電子氧化或兩電子氧化過程中,對于UV-vis定量和肉眼讀數(shù)均具有合理的穩(wěn)定性。
圖四、聯(lián)苯胺衍生物的氧化產(chǎn)物的穩(wěn)定性研究表征圖。
另外,2OCH32CH3的單電子和兩電子氧化產(chǎn)物的光譜類似于2CH3和4CH3(TMB)的光譜;4OCH3的單電子和兩電子氧化產(chǎn)物的光譜出現(xiàn)重疊。RGB值所揭示了這些四取代底物的氧化產(chǎn)物的色純度通常也優(yōu)于聯(lián)苯胺和二取代衍生物。另外,2OCH32CH3的單電子氧化產(chǎn)物的穩(wěn)定性較差,這可能是因為氧化還原峰的電位差較小;4OCH3的單電子氧化產(chǎn)物的穩(wěn)定性甚至更低,而兩個氧化還原峰幾乎沒有任何特征。對于雙電子氧化產(chǎn)物和原始化合物的穩(wěn)定性,4CH3(TMB)的性能仍優(yōu)于2OCH32CH3和4OCH3。因此,在低致癌性四取代底物中,TMB仍然具有最高的靈敏度,色純度和合理的穩(wěn)定性。
圖五、四取代-聯(lián)苯胺衍生物的氧化產(chǎn)物的穩(wěn)定性研究表征圖。
小結(jié):四川大學吳鵬教授課題組從發(fā)色反應(yīng)和分子特性探討了TMB作為比色測定中選定底物的基本原理。通過發(fā)色系統(tǒng)的研究,證明TMB表現(xiàn)出優(yōu)于其他聯(lián)苯胺衍生物的最佳靈敏度。單電子氧化產(chǎn)物和兩電子氧化產(chǎn)物之間明顯的電勢差使其成為定量分析的最佳選擇。TMB作為顯示底物不僅與其低毒性有關(guān),還與其分析性能以及分子特性有關(guān)。另外,甲基取代的聯(lián)苯胺(2CH3、4CH3和2OCH32CH3)的性能通常優(yōu)于其他類似物。四取代的衍生物大多優(yōu)于二取代的衍生物。