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掌握還原糖和總糖測(cè)定的基本原理,學(xué)習(xí)比色法測(cè)定還原糖的操作方法和分光光度計(jì)的使用。
還原糖的測(cè)定是糖定量測(cè)定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類,單糖都是還原糖,雙糖和多糖不一定是還原糖,其中乳糖和麥芽糖是還原糖,蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同,可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來(lái),對(duì)沒(méi)有還原性的雙糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測(cè)定,再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量(還原糖以葡萄糖含量計(jì))。
還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物,3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi),還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系,利用分光光度計(jì),在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值,查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算,便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時(shí),每斷裂一個(gè)糖苷鍵需加入一分子水,所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以0.9。
取7支20mL 具塞刻度試管編號(hào),按表1分別加入濃度為1mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑,配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。
(1)還原糖的提取
準(zhǔn)確稱取3.00g 食用面粉,放入100mL 燒杯中,先用少量蒸餾水調(diào)成糊狀,然后加入50mL 蒸餾水,攪勻,置于50℃恒溫水浴中保溫20min,使還原糖浸出。將浸出液(含沉淀)轉(zhuǎn)移到50mL 離心管中,于4000r/min下離心5min,沉淀可用20mL 蒸餾水洗一次,再離心,將二次離心的上清液收集在100mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,混勻,作為還原糖待測(cè)液。
(2)總糖的水解和提取
準(zhǔn)確稱取1.00g食用面粉,放入100mL三角瓶中,加15mL蒸餾水及10mL 6M HCl,置沸水浴中加熱水解30min(水解是否完全可用碘-碘化鉀溶液檢查)。待三角瓶中的水解液冷卻后,加入1 滴酚酞指示劑,用6mol/LNaOH 中和至微紅色,用蒸餾水定容在100mL容量瓶中,混勻。將定容后的水解液過(guò)濾,取濾液10mL,移入另一100mL容量瓶中定容,混勻,作為總糖待測(cè)液。
(3)顯色和比色
取4支20mL 具塞刻度試管,編號(hào),按表2 所示分別加入待測(cè)液和顯色劑,空白調(diào)零可使用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的0號(hào)管。加熱、定容和比色等其余操作與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。